ミニ プレップ。 プラスミドミニキット

いろんな種類と形がある「フードプロセッサー」の使い方②(クイジナートとキッチンエイド編)

ミニ プレップ

BioTechnicalフォーラム [プラスミド抽出におけるRNase処理]• バイオ関連の実験をする上での、試薬、機器、プロトコールなどの情報交換の場です。 新しいテーマで話を始める場合、質問をする場合は「」から書き込みをしてください。 質問に対して解答できる方は是非、書き込んで下さい。 このフォーラムにふさわしくないと管理人が判断した投稿は予告なく削除します。 プラスミド抽出におけるRNase処理 No. とても基礎的な内容で大変申し訳ないのですが、 どうしても気になったことがあり質問させて頂きました。 私の所属する研究室ではプラスミドの抽出の際、 キアゲンのキットを用いています。 このキットのプロトコルではRNaseを添加しているバッファーで懸濁を行い、 その後アルカリSDS法によりゲノムやタンパク質を除去しているのですが、 このRNaseはどのタイミングで効いているのでしょうか。 RNaseもSDSによって変性されていると思うのですが、 大腸菌のペレットを懸濁した時にはもうRNaseは その役割を果たしているものなのでしょうか。 基礎的な内容で大変申し訳ないのですが、 ご存知の方がいらっしゃれば、ご教授お願いします。 無題 No. 制限酵素処理をするだけであればRNase抜きでミニプレップして、制限酵素処理の時にRNaseを入れれば言い訳で、その後バンドを見るとか、切り出すだけであれば分解された短いRNAやRNaseは入っていても電気えいどうはできます。 バクテリアにトランスフォーメーションしたり、PCR、コンストラクションを作ったりするのにはRNAやRNaseの多少の混入はほとんど問題がないと思います。 そういう目的ならきっとを使わないRNase抜きで精製後RNase加えてもさらにフェのクロの必要がないかもしれません。 フェのクロしても完全にRNaseが抜けてないかもしれませんよ場合によっては。 またエタチンのキャリア-としてtRNAを加えることもあります。 それとカラムにのっける前に変性させるという意見がありますが、変性後リフォールディングするので意味がありません。 またQIAGENのきっとは変性剤を使ってないイオン交換カラムの物もあります。 RNaseを加えないでカラムなどにのせた時の心配なのは、RNAもカラムに親和性がありますから、DNAと競合するばあいです。 長いRNAほど吸着力が強くなりますから競合しやすくなります。 無題 No. 私はキット世代でないので、修士のときは自分で試薬を調製してミニプレップをしていました。 そのときは、RNase を最後に加えていました。 RNase なしでは、ボワッとしたRNAのバンドがはっきり見えますよ。 ラージはセシクロで精製したのでRNAのコンタミはなく、酵素処理は必要ありませんでしたが。 面倒だからやらないのは確かですが、キットを使いながらあえて除いてやる必要性はないですよね。 無題 No. IにRNaseを入れる 教科書的なアルカリ法だとRNaseをかけずにフェノクロ・エタ沈までやってTEに懸濁してからあらためてRNase処理ののちフェノクロ・エタ沈・・・ってめんどくさくてやってられませんよね。 RNase処理の効率といった観点からは無駄に大過剰加えていることになるので「間違った」方法でしょうけど、結果としてちゃんとRNAが除けているし、カラム精製のキットならたいていの場合binding solutionにグアニジンが大量に入っててその時点でRNaseの失活も望めるので、一石二鳥で悪くない方法だと思いますよ。 無題 No. 確かにwash bufferの塩濃度次第では、簡単に除去できそうですね。 そしてRNaseを懸濁bufferに加えておくのは、 やはりその保存状態のためという意見が個人的にはしっくりきた気がします。 しかしそれだとやはり間違ったプロトコールさんの言う通り プロトコールが間違っている、もしくは間違っていないまでも 少し効率の悪いプロトコールであるように感じてしまいます。 ところで最近知ったのですが、うちの研究室の少数派の人たちは BIO-RADプラスミド精製キットを用いており、 そのキットではどうやらRNaseを用いていないそうです。 なので当然RNAは最後までコンタミしっぱなしなのですが、 濃度を測定するときに、濃度を測定値より少し少なく見積もる程度で 他は特に気にすることなく実験を進めていらっしゃいます。 その後の実験次第ではありますが、もしかしたらRNAのコンタミは さほど気にすることでもないのかもしれないと考えさせられてしまいました… 無題 No. RNaseのリフォールディングは、かーーなり強力で、 たしか高濃度のUreaにさらして変性しても、 Ureaを除去すると、RNaseは元の構造に戻る すみません、完全に理解できていないのですが、 SDSが沈殿するときに、SDSが疎水性相互作用によって 結合しているタンパク質もSDSと共に沈殿するということはないのでしょうか。 もしそうならやはりP2を加えたときにRNaseが働いているんですかね? あともう一つ気になったんですが、P2もしくはP3を加えたときに RNaseが働いてるんでしたら、なんで最初の懸濁bufferに RNaseを加えておくのでしょうか? 質問ばかりして申し訳ないのですが、是非知恵を拝借したいです。 再度 No. これゆえ、高次構造が強固に保たれているようです。 逆に還元剤には弱そうですね。 アルカリバッファーにはナトリウムイオン、中和バッファーにはカリウムイオンが入っています。 ちなみに、SDS-Na から不溶性の SDS-Kになることで、白い凝集体がゲノムDNAを巻き込んで沈殿します。 0 and 4. A major application for RNase A is the removal of RNA from preparations of plasmid DNA. 無題 No. At 100 。紊, an RNase A solution is most stable betwee、ユn pH 2. 0 and 4. RNase A is stable to both heat and detergents. A major application for RNase A is the removal of RNA from preparations of plasmid DNA. 無題 No. また、RNaseに対するSDSの効果としては Structure and Activity of RNase A in Sodium Dodecyl Sulphate Solutions と言うタイトルの論文があるようですが、読む事が出来ませんでした。 もし、どなかか可能ならば、RNaseありなしとかで各ステップのフラクションをアガロースゲル電気泳動にかけて確かめて欲しいです。 (そんな暇な人はいないですね・・・。 )キアゲンなどメーカーにはそのようなデータもきっとあるんでしょうね。 パスワード を入力してチェックした記事を チェックした記事を このトピックにメッセージを投稿する 名前 メール アドレス非公開 タイトル 本文 設定 クッキーを保存(次回の入力の手間を省けます) 上に上げない(トピックの一覧で一番上に移動させません) 解決(問題が解決した際にチェックしてください) 暗証 半角英数字8-12文字の暗証番号を入れると、あとで削除、修正ができます。 送信 〔使い方〕• 「アドレス非公開」をチェックすれば、自分のメールアドレスを公開しないで他の方からメールを受け取れます。 問題が解決した際には、解決ボタンをチェックして解決した旨のコメントをつけてください。 これは、初めにトピックを作った人と管理人のみが可能です。

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様々な用途に使用する上で十分な量のDNAを確保できる多収量ミニカラムシステムです。 本製品は、改良されたアルカリ溶菌法に基づいています。 RNase処理によりゲノミックDNAとRNAをごく微量しか含まない細胞溶解液を抽出します。 溶解液中のプラスミドDNAは、カオトロピック塩の存在下で、スピンカラム内のグラスファイバー充填材に結合します。 Wash Buffer(エタノール)で不純物を洗い流した後、Elution Buffer(低塩濃度の溶出緩衝液)を加えることにより、精製されたプラスミドDNAが抽出されます。 性能 対象サンプル: バクテリアから抽出したプラスミドDNA サンプル量: バクテリア培養液 1〜4ml 標準プラスミド収量: 低コピー数 0. 5 44. 5 43. 4 115. 8 123. 5 19. 7 18. 99 5. 01 5. 43 0. 88 0. 83 0. 92 1. 91 1. 91 1. 78 2. 03 1. 詳細はお問合せ下さい。 診断・治療には使用しないで下さい。 《お問合せ先》 Email : rbc scitrove. - All rights reserved.

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サイトローブ 製品情報 RBC プラスミド抽出ミニキット

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BioTechnicalフォーラム [大腸菌の収量について]• バイオ関連の実験をする上での、試薬、機器、プロトコールなどの情報交換の場です。 質問に対して解答できる方は是非、書き込んで下さい。 このフォーラムにふさわしくないと管理人が判断した投稿は予告なく削除します。 大腸菌の収量について No. 色々なスレッドでもこのような問題の解決法が記載されていましたがそれでも解決できなかったので何かご意見を頂けないでしょうか。 形質転換したDNAはquick changeの方法で作成したインサートとベクターのtotal6. 5kbp程です。 すみませんがどちらも実名を挙げることは控えさせてください。 使用している大腸菌はtakaraのHB101です。 あるタンパク質のポイントミューテーションを複数作成していて、その中の一部でこのような現象が起きてしまったので、DNA回収に至るまでの操作は問題がないかと思っております。 行った解決策は 1. AMPの量を4倍加える AMPは培養の初期段階でなくなってしまい、競合的に耐性を獲得していない菌が増殖する場合があるとのことを伺ったので2倍、4倍と振ってみましたがDNA収量は同様に低いままでした。 再形質転換 得られたDNAを再形質転換を行ってシングルコロニーからミニプレップまで行ったのですが同様の結果でした。 培養時間の変更 通常は16時間で行っていたのですが24時間、12時間で行ったのですが同様の結果でした。 ただ、24時間では培地から硫黄臭がし、酵母などは増えすぎるとそのような気体を出すと記載されていたので、そのせいで液性が変わり、最終のDNA液がN3を加えた段階でトラップできないのかと考えましたが違ったようです。 考えられた原因はコロニーを長期保存しすぎ 3週間 たのでコピー数の減少化と思いましたが再形質転換でも解決できなかったことから違うところに原因があるようです。 実験の本質的な部分がわかっていなく的を得て質問できていないかもしれませんがご意見を頂けると幸いです。 つたない文章ですが最後まで目を通していただいてありがとうございます。 無題 No. ミニプレップなどの培養には2日前に再形質転換を行ったプレートからシングルコロニーをピックアップし、培養することで解決しようと思います。 310様 ODから増殖曲線を引くわけですね。 毒性タンパクが死滅期で効いてくるの場合は310様のように対数曲線内での増殖にとどめることは有効ということでしょうか。 やってみようと思います。 また、やはり、皆様のご指摘のようにAMPの失活も考慮に入れた方がよいように思えたので、新しいもので、一度行ってみようかと思います。 AP様 colE1 replicon1にも種類があるのですか。 ベクターの情報を再度確認したのですがcolE1 repliconとしか記載されていなく、このような場合は、シークエンスから由来がわかるのでしょうか。 ベクターの骨格についても、記載されていないのか、身落とししているのかわからないので説明書のどの部分を確認すればよいのでしょうか。 カナマイシンについては安易に考えすぎました。 pLysS株についてベクターにも、大腸菌genotypeにもT7 RNA polと記載されていないので今回は用いることができないように思います。 ただ、ベクターのPropagation in E. coliという部位にcopy number highと記載されていて、これはベクターの機能か、形質転換に求められるコンピテントセルに求められる性質かわかりませんが、後者であるならコピー数の高くなる大腸菌に再形質転換を行いたいと思います。 teriffic brothはラボにあるのでやってみようと思います。 ンンノ様 ミニプレップの全培養にて低温培養を検討してみます。 中年様 ベクター説明書にはcolE1 oriとしか記載されていなかったのでどちら由来かは申し訳ないのですがわからなかったです。 無題 No. とにかく、これまでの論議で質問者さんは、はじめに言った、特定のベクター名を明らかにできなくても、ベクターの骨格(たとえばpUCベースだとかpBRベースだとか)を明かす必要がある、という点は理解されたんじゃないでしょうか。 それによって、有効な手段、有効ではない手段が決まってきますので。 とりうる対処法としてひとつ付け加えると、培地をリッチなもの、2xYTとかTerrific brothなどに変えてみるというのもあります。 たとえばTerrific brothだと同じ培養スケールでもLBの5倍くらいの菌数が得られますので、スケールアップと同等の結果が得られます。 無題 No. 原理的に、野生型pMB1や、pBR322などのcolE1 repliconにこの効果をもとめるのは意味がないはず。 作用機序がタンパク質合成阻害だからといって、クロラムフェニコールをカナマイシンに置き換えることはできません。 濃度にもよると思いますが、カナマイシンは静菌的作用より殺菌的作用が強いので、コピー数をふやすより先に死んでしまうでしょう。 pLysSはコードされるT7 lysozymeがT7 RNA polに結合して転写を阻害することで発現を抑えます。 ベクターにT7プロモータがあっても、宿主ーベクター系にT7 RNA polの遺伝子がなければ意味ないでしょう。 OD600 No. これだと収量はやや少なめになるので、できる限り培養本数をふやすと良いでしょう。 最近使っているのはSmart Ampicillinです。 日本ではコスモバイオ 及びフナコシで購入できます。 寒天培地用に購入したのですが、液体培地でも使ったところ気持ち収率が上がったような気がしました。 抗生物質の失活は形質転換してない大腸菌を入れて一晩培養すれば分かりますので、ネガコンとして形質転換菌と一緒の培養機で培養しています。 本当にSmart Ampicillinが分解されないアンピシリンなのかは私では分かりません。 多分分解しにくい程度ではと思っています。 このため夕方から培地数mlで数時間培養し、遠心して8mlの培地に再縣濁して一晩培養した後に遠心チューブに培養液をデカントで移し、チューブにちょっと残った培養液に再度培地を加え、ミニプレップで収量が悪いとき夕方に再度行えるように培養します。 私が使う程度のプラスミドはこれで大体まかなえます。 無題 No. KANなどでは、抗生物質耐性はbacteria instrinsicなので、耐性の有る無しでクローンの選択が可能。 それに対してbeta lactamaseによる耐性は分泌を介するので、プラスミドが落ちていようといまいと培地中にbeta lactamaseが存在すれば短時間で加えたampが分解されてしまうので、個々のbacteriaが耐性を持っていようがいまいがクローンレベルでの選択制はそれほど期待できない。 それに、Ampはbactericidalではなくbacteristaticなのでampを加えたからといって非耐性の菌が即座に死にことはない。 細胞壁の合成の阻害剤なので、増えなくなるというのが選択の機序。 無題 No. つまり、菌体量は当てにならないということです。 低温培養はコピー数は落ちますが、毒性が緩和されれば培養毎に取れたり取れなかったりというトラブルからは開放されます。 「抗生剤の再添加について」 回収する際の大腸菌の状態 濁度もしくは培養時間 :培地がはっきり濁った頃で良いと思います。 再添加する抗生剤の量:いつもと同じ。 ここで目指していることは、菌のポピュレーションの内でプラスミドを落としているもののみを殺すことなので。 再添加してからどれくらい培養するのか:再添加というより培養再開ということですが、その時点でプラスミドを持った菌のみが生き残るので、しばらくすると濁度は急に落ちます。 この後、どれだけ培養を続けるかは、毒性によりけり。 必要ならこの操作を何度か繰り返して、最後はover night culture並の濁度に持ち込んだほうが収量が稼げるでしょう。 無題 No. それにより、毒性タンパク質のE. coliに与える影響を軽減できるんですか。 培地はLB培地でグルコースは添加していませんが、ベクターにはLacオペロンは入っていないのでこの方法は使えないようです。 pLysSを持つ株の使用について この大腸菌由来のT7 Lysozyme はベクター由来のT7 RNA polymerase を阻害するので毒性タンパク質の発現による影響が軽減できるんですね。 皆さんから教えていただいたcopy numberが気になりますが、他の研究室から少しだけならコンピテントセルを頂けるかもしれないので、このような株を頂けないかどうか伺ってみようと思います。 10倍培養について 最終的に他の手がなかったら実行してみようと思います。 ある程度の培養まで行いクロラムフェニコールを添加すると、大腸菌は増殖できないが、増殖する準備だけが盛んに起こり、copy数が上がるとどこかに書いてあったので、これと併用したいと思います。 アンピシリンとは異なり、クロラムフェニコールのようにタンパク質合成時点で阻害するカナマイシンで代用してみようと思います。 ンンノ様 シングルコロニーをリストーク シングルコロニーだと思い複数のコロニーをピックアップしてしまった場合に有効ということですね。 やってみようと思います。 参考までに通常はどのような条件で行うのかお教え願えますか。 中年様 毒性とコロニーの形態について コロニーのサイズが小さかったり、透明だったり、盛り上がりが薄かったりはしていませんでした。 ただ、ポイントミューテーションの位置が違うだけでそのような差が出るというのは驚きでした。 低温培養について 毒性は少々あるかもしれませんが、懸濁液として回収できるので、コピー数に問題があるのではないかという気がしてきました。 今の収量がさらに減ってしまう可能性があるとのことで、他の方法でできなければ行ってみようと思います。 抗生剤の再添加について 一度遠心して、再懸濁、再添加する必要があるのですね。 差し支えなければ、回収する際の大腸菌の状態 濁度もしくは培養時間 、や再添加する抗生剤の量、そして再添加してからどれくらい培養するのか 濁度もしくは培養時間 についてお教え願えますでしょうか。 無題 No. www. kenkyuu. cgi? kenkyuu. cgi? kenkyuu. cgi? kenkyuu. cgi? 正直言ってここまで助言を頂くことができるとは思っていなかったのでうれしい限りです。 さてかなり初歩的なことに躓いてしまっていると感じ、当惑しているため適切な情報が記載できていないように思いますので少し補足させてください不要な情報でしたらすみません。 現在はクローニングを行いQuick changeの方法でポイントミューテーションを複数作成し、発現ベクターの作成を試みております。 と思い当惑していました。 ちなみにこれらはベクターの骨格が同じでポイントミューテーションの位置がそれぞれ違うだけです。 無題 No. 良く取れるクローンに比べて、コロニーのサイズが小さかったり、透明だったり、盛り上がりが薄かったりしませんか。 その場合は、皆さんお書きになっているように、低温培養が有効だと思います。 ただし、これはコピー数を落として毒性を緩和する方法ですので、クローン毎のバラツキは少なくなりますが収量は落ちますので、培養スケールは5倍程度に増やす必要があります。 また、Ampを2-4倍になるように途中で加えたとありますが、バリバリの菌体外酵素による分解なのでそんなものじゃ全然足りません。 遠心して菌体を回収し、一度培地で洗ってから新たにAmp入りの培地に懸濁し直す必要があります。 無題 No. は以前の話であり、条件も何もありませんよね。 グルコース添加? Lacオペロンを使っているのであれば、抑制を強めることが出来ます。 pLysSを持つ株の使用? 毒性タンパク質の分解を促進できます。 10倍培養する? 何も考える必要がありません。 必要量が今の10倍で、現在の培養が3mLであれば、10本培養することをお勧めします。 他の検討と異なり、一切の条件検討が要りません。 後でカラムに吸着させる段階で1本にまとめるか、エタ沈でまとめればいいでしょう。 質を心配しているようですが、分析ではなくプロセスによって品質を確保したいのであれば、一切のプロセスを変更しないのが近道です。 それで不要物が10倍に増えると考えるのであれば、条件を変更させたときにその不要物が変動しないことを調べる必要があるでしょう。

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